类器官研究进展之四类角膜

“心灵的窗户”——眼睛是人和动物感知光线的器官，由眼球和眼的附属器官组成。角膜是眼球前壁的一层透明膜，因其位于眼睛的最外层且呈凸形所以容易受到损伤。在这种情况下，类角膜组织应运而生。本文将从角膜的基本结构与功能、类角膜的研究进展及挑战等方面进行详细介绍。

角膜呈横椭圆形，由上皮细胞层、前弹力层、基质层、后弹力层、内皮细胞层组成。它既是光线进入视觉系统的入口，也是重要的机体防御屏障。角膜的发育始于覆盖在晶状体囊泡的表面外胚层，晶状体囊泡与外胚层之间的相互作用，会促使由神经嵴衍生的间质细胞的迁移，形成内皮细胞，最终形成基质角化细胞。

图1.角膜结构（图由SChen和XLiu提供）

角膜位于眼睛的最外层，感染细菌、真菌、病毒或外伤等容易使角膜受到损伤，导致角膜瘢痕、角膜营养不良、角膜变薄、角膜浑浊、角膜内皮衰竭、穿孔的角膜病变等后果，致使眼睛视力下降，严重的还会导致失明。角膜疾病占全世界致盲性眼病的第二位，角膜致盲占全部盲人总数的1/4，在全球人群中患角膜疾病的人数超过万。对于严重的角膜疾病患者来说，目前角膜移植仍然是确切有效的方法，手术成功率高达86%。然而捐献的角膜材料严重缺乏，我国每年需进行角膜移植的患者约30万，因角膜供体的缺乏每年实施手术的病人不到例。由于捐赠者组织不易获得，且术后存在免疫排斥风险及其他并发症，促使科学家们寻找新的替代方案。

表1.角膜疾病治疗方法的历史性进展（图由PramodKumar和AbhayPandit提供）

类角膜构建的研究进展

人工角膜（keratoprosthesis）虽被批准应用于临床，但因其生物相容性差、术后并发症多，很难在临床上推广。为了达到理想的治疗效果，构建类角膜组织显得极为重要。类角膜的出现，标志着角膜移植进入了一个新的时代。“类角膜”顾名思义就是有着与角膜相似结构和功能的角膜替代物，是通过将体外培养的种子细胞接种于可降解的生物支架材料上来构建的。因此，类角膜的构建需要从体外获得种子细胞和支架材料两个方面入手。

种子细胞的理想选择有角膜缘干细胞、人类角膜基质干细胞等。通过对捐赠的人类角膜进行活组织切片检查，可以获得活检来源的角膜缘基质细胞（Limbalbiopsy-derivedstromalcells，LBSCs）。在含有自体血清的培养基中，此类细胞会迅速扩增、成球，并表达干细胞基因。人LBSCs可以分化成具有特定标记基因的角化细胞，并形成厚的间质层状组织。将层状组织被移植到小鼠的角膜伤口，可以阻止瘢痕组织的形成，并使损伤的基质再生。还有研究表明，活检来源的角膜缘基质细胞不仅能在体外分化出功能性角化细胞，还能在体内诱导受损基质细胞的再生，从而形成一个与原生角膜无法区分的基质。此外，从人类胚胎干细胞中分化获得的角膜缘干细胞（Limbalstemcells，LSCs）在体外表现出很强的增殖及分化能力，这些细胞在角膜基质上会形成层状上皮细胞层，基底细胞仍然保留着LSCs的特征。这对于角膜疾病的治疗有很大的潜力。

图2.P0代和P3代LBSCs（图由SayanBasu和AndrewJ提供）

此外，通过流式细胞分选获得的人类角膜基质干细胞（Humancornealstromalstemcells，hCSSC）也会诱导角化细胞的基因表达，最终形成类似角膜基质组织的结构。

人类的羊膜上皮细胞（humanamnioticepithelia，HAE）由羊膜母细胞获得，采用剖腹产手术取出人类的羊膜用胶原酶消化以获取HAE细胞，再按特定的条件进行细胞培养。有研究表明，HAE细胞具有胚胎干细胞的一些特征。HAE细胞几乎不引起免疫应答，用HAE细胞和兔眼角膜基质来重建角膜瓣在细胞替代疗法中得到广泛应用。

要构建类角膜，除了合适的种子细胞外，支架也是必不可少的。支架材料要具有适合的力学强度，抵抗外界压力并维持组织的完整性和原有的形状，同时还可以模拟正常细胞发挥功能所需要的生理组织结构；目前研究中的类角膜组织支架类型主要有羊膜支架、胶原蛋白支架和胶原蛋白聚合物支架。

人类羊膜(humanamnioticmembrane,HAM)是无血管的透明薄膜，位于胎膜内层，包含单层上皮细胞、较厚的基底膜及无血管基质，可通过被丢弃的胎盘获得，年在眼科疾病中首次得到了应用，作为一种眼部表面贴剂已经被证明具有抗免疫和抗炎特性。研究发现羊膜促进可以角膜角化细胞的表型维护，通过调节TGF-1对角质层进行预调节和维持细胞形态。

图3.在HAM支架上培养LSCs（图由ChuanGu和JunYang提供）

角膜上皮是一种能快速再生的分层上皮，对保持角膜透明度和完整的眼球表面起着至关重要的作用。角膜上皮细胞是由角膜缘干细胞（LSCs）分化形成的。一些因素包括化学或热损伤或严重疾病，如史蒂文斯-约翰逊综合征，可能致使LSCs的丧失或功能障碍，会导致角膜上皮细胞内稳态紊乱，出现角膜血管化、慢性炎症、甚至失明。在人羊膜支架上培养的角膜缘干细胞可以呈现角膜上皮的表型，对于治疗受损的角膜上皮细胞有重大意义。

胶原蛋白是原生角膜组织的主要组成成分，Ⅰ型胶原水凝胶支架非常适合用于构建组织工程角膜，研究结果显示角膜上皮细胞可在Ⅰ型胶原水凝胶支架上黏附、增殖与复层。因其具有优良的生物降解性和生物相容性，同时具有较低的免疫原性，被视为制备生物工程角膜结构的合适基质。然而，传统胶原凝胶的高度水化特性使其在结构上变得脆弱，难以操作。

Connonetal.等人研究发现，定向排列在一起的胶原纤维明显更厚，密度更大，具有更好的机械性能。他们采取塑料压缩胶原蛋白PC和激光穿孔的PLGA电纺支架进行组合，所产生的胶原蛋白聚合物混合结构有良好的力学性能和优异的生物相容性，适用于作为类角膜组织来培养种子细胞，构建类角膜。此外，胶原蛋白磷酸氢胆碱水凝胶也表现出非常好的生物特性和透明度，同时可促进基质和上皮组织的再生；胶原蛋白玻璃胶(CV)也为角膜修复提供了一种可行的方法。

图4.电镜下的纯PLGA支架（左）混合支架（中）中间的电纺PLGA垫子（红色星号）紧紧地粘在胶原层上（红色箭头）（右）（图由BinKong和WeiSun提供）

表2.三种类型支架的优缺点比较

类角膜构建的挑战

类角膜组织为眼睛疾病的治愈带来了很大的希望，但同时也面临着一些挑战。将体外培养的种子细胞接种于可降解的生物支架材料上来构建类角膜，虽然它的结构、功能与角膜类似，但是与真正意义上的角膜还是存在一定的差异，不能够完全来替代。

在细胞组成方面，类角膜虽然包含一些必要的细胞类型，但血管结构和免疫细胞会有所缺失，并且会影响新生血管的生成。成人的角膜单层细胞会丧失增殖能力，数量会下降。如何提高类角膜的成熟度将是科学家们未来研究的一个重要方向。

结语

通过对类角膜的构建，我们深入了解了角膜的基本结构以及其行使的功能，促使科学家们更深入研究内稳态及疾病发生过程，并使类角膜作为更好的移植物呈现在生物和医学研究者们面前。类角膜应用于临床时，不仅要对细胞、支架的性能进行优化，还要对其组织重建速率、炎性反应及重建角膜内皮细胞功能等方面进行深入研究。另外，还要考虑支架材料是否易于消毒及便于器械操作、是否可以大规模生产，这些要素在实际临床应用中都非常重要。

类角膜研究的进展，大力推动了角膜疾病的研究进程，为角膜疾病的治愈带来了曙光。相信通过科学家们的不懈努力，类角膜的发展会更加光明，将会迎来属于角膜疾病患者的春天。

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